A ce jour, il n'existe aucune méthode normalisée de détection des OGM et produits dérivés, tant en France qu'au niveau européen. Afin de palier à ces manquements, les Pouvoirs Publics ont mis en place une commission de normalisation " détection des OGM et produits dérivés ". Sous l'égide de l'AFNOR, cette commission, à laquelle participe activement le laboratoire ifra, élabore une norme expérimentale qui vise à rendre compatible les méthodes actuellement utilisées dans les laboratoires publics et privés. Cette norme expérimentale devrait être disponible d'ici mai 2000.
Anticipant l'adoption par les laboratoires de contrôle de modes opératoires normalisés, le laboratoire ifra a mis au point des méthodes de détection sensibles et quantitatives des OGM, basées sur les techniques modernes d'analyse de l'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) suivant différents protocoles analytiques adaptés aux produits analysés et aux séquences d'ADN recherchées. Ces méthodes de détection suivent les recommandations de la commission de normalisation " détection des OGM et produits dérivés ".
Les analyses se déroulent selon une procédure en plusieurs étapes et durent en moyenne un jour et demi. Pour chacun des échantillons à tester, l'extraction est réalisée en double. Le laboratoire ifra a mis au point une méthode d'extraction d'ADN à l'aide de kits commercialisés par la société Qlagen. Des adaptations ont été apportées au protocole d'extraction afin de pouvoir appliquer cette méthode sur la grande majorité des produits dérivés de m;iis ou de soja (graines, farine, semoule, gluten, corn flakes, amidons et dérivés, extrait protéique, sirop de glucose, lait de soja, tourteau, lécithine, etc ... ). Lorsque le dosage de l'ADN extrait est possible, la quantification est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre.
Pour nos réactions de PCR, différents couples d'amorces peuvent être utilisés en fonction de l'analyse demandée. Pour chaque couple d'amorces, un programme d'amplification PCR à 45 cycles est utilisé. Sur chaque ADN extrait, au minimum deux réactions de PCR sont réalisées. Pour chaque série de PCR, au minimum quatre contrôles (positifs et négatifs) sont utilisés afin de pouvoir valider les résultats des tests avec certitude. Lorsque les contrôles ne donnent pas de résultats satisfaisants, tous les résultats de la série d'analyses sont rejetés et l'analyse est recommencée au stade PCR ou extraction.
A l'ifra, l'amplification d'une séquence au moyen de la technique PCR, la détection et la quantification des produits d'amplification se font sur un appareil ABI Prism 7700 commercialisé par la société Perkin Elmer. Cet appareil permet une lecture en temps réel du résultat d'amplification. De plus, par le biais de PCR mutiplex, il est possible d'effectuer une quantification très précise des OGM.
En absence d'information sur le produit à analyser, la détection de la présence d'ADN d'origine OGM se fait par une méthode de criblage du promoteur 35S du virus de la mosdfque du chou-fleur. Cette séquence est présente dans le génome de toutes les plantes transgéniques autorisées par la CE à la commercialisation en France (m;ifs Btl76, m;ifs Btl 1, m@fs MON8 10, mais T25 et soja RRS), et plus généralement dans le génome de la majorité des plantes transgéniques recensées à ce jour mais n'ayant pas encore obtenu d'autorisation de mise sur le marché. Ce test PCR permet de révéler la présence ou non de séquences d'origine OGM (de type promoteur 35S) dans un échantillon. Dans le cas d'une réponse négative, le test P35S permet de conclure à l'absence d'ADN d'origine OGM. Dans le cas d'une réponse positive, ce test pen-net de quantifier la proportion d'ADN d'origine P35S par rapport à l'ADN de l'espèce végétale pour des matrices simples. Cette quantification est directe et précise sur l'ABI Prism 7700 car il est possible de réaliser les deux réactions PCR simultanément dans un même tube. Il est toutefois recommandé de procéder à l'identification du ou des transgènes présents pour confirmer les résultats d'une analyse d'OGM de type quantitatif.
Outre le test P35S, il est également possible de réaliser un test Tnos pour la détection d'une séquence du terminateur nos. En effet, cette séquence est également présente dans le génome de certaines plantes transgéniques autorisées par la CE à la commercialisation en France (mais Btl 1, mais MON810 et soja RRS). En revanche, cette séquence étant absente du génome de 2 mais transgéniques (mais Btl76 et m;ifs T25), le test Tnos est moins puissant que le test P35S.
A ce jour, les seuls standards certifiés commercialisés ont été élaborés soit à partir du mais Btl76 (qui ne contient pas le promoteur nos), soit à partir du soja RRS et plus récemment à partir de maïs Btl 1. En revanche, aucun standard certifié n'est disponible pour les m;ifs MON810 et T25.
L'absence de fragment d'amplification signifie soit l'absence d'ADN d'origine OGM, soit une inhibition de la réaction PCR, soit l'absence d'ADN extractible dans la matrice. C'est pourquoi, il est préférable de s'assurer que l'ADN extrait est amplifiable. Nous disposons de plusieurs couples d'amorces nous permettant de révéler la présence d'un gène existant de manière constitutive dans l'espèce végétale suspectée d'intervenir dans la composition de produit analysé. Ainsi, si le produit à analyser est à base de soja, nous vérifierons que la réaction PCR n'est pas inhibée en mettant en évidence la présence du gène de lectine. Si le produit à analyser est à base de ma:fs, nous vérifierons que la réaction PCR n'est pas inhibée en mettant en évidence la présence du gène de zéine. Dans le cas de matrices complexes (à base de mais et de soja), il est nécessaire de réaliser les deux types de réactions. L'amplification d'un gène de l'espèce permet de valider les résultats obtenus avec le test 35S. En revanche, l'absence de fragment d'amplification signifie soit l'absence d'ADN de l'espèce, soit une inhibition de la réaction PCR. C'est pourquoi, nous vérifions que l'ADN extrait est amplifiable en ajoutant dans le tube de réaction PCR une quantité limite d'un standard positif.
Le laboratoire ifra a mis au point une méthode de détection sensible et quantitative des OGM. L'utilisation de la technologie TaqMan (PCR à déplacement de sonde fluorescente) nous permet aujourd'hui de détecter moins de 10 pg d'ADN OGM. Nous sommes à même de déceler la présence d'une graine de mais ou de soja transgénique au milieu d'une dizaines de kilogrammes de mais ou de soja traditionnel, ce qui nous permet de distinguer les vrais mélanges avec des graines transgéniques, de contaminations accidentelles lors du transport, du stockage ou de la transformation des matières premières.
taille de l'échantillon doit être d'au moins 100 grammes.
Merci à toutes les petites fourmis (non transgéniques) pour la collecte des infos.