A ce jour, il
n'existe aucune méthode normalisée de détection des OGM et produits dérivés, tant en
France qu'au niveau européen. Afin de palier à ces manquements, les Pouvoirs Publics ont
mis en place une commission de normalisation " détection des OGM et produits
dérivés ". Sous l'égide de l'AFNOR, cette commission, à laquelle participe
activement le laboratoire ifra, élabore une norme expérimentale qui vise à
rendre compatible les méthodes actuellement utilisées dans les laboratoires publics et
privés. Cette norme expérimentale devrait être disponible d'ici mai 2000.
Anticipant l'adoption par les
laboratoires de contrôle de modes opératoires normalisés, le laboratoire ifra a
mis au point des méthodes de détection sensibles et quantitatives des OGM, basées sur
les techniques modernes d'analyse de l'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) suivant
différents protocoles analytiques adaptés aux produits analysés et aux séquences d'ADN
recherchées. Ces méthodes de détection suivent les recommandations de la commission de
normalisation " détection des OGM et produits dérivés ".
Les analyses se déroulent selon
une procédure en plusieurs étapes et durent en moyenne un jour et demi. Pour chacun des
échantillons à tester, l'extraction est réalisée en double. Le laboratoire ifra a
mis au point une méthode d'extraction d'ADN à l'aide de kits commercialisés par la
société Qlagen. Des adaptations ont été apportées au protocole d'extraction afin de
pouvoir appliquer cette méthode sur la grande majorité des produits dérivés de m;iis
ou de soja (graines, farine, semoule, gluten, corn flakes, amidons et dérivés, extrait
protéique, sirop de glucose, lait de soja, tourteau, lécithine, etc ... ). Lorsque le
dosage de l'ADN extrait est possible, la quantification est effectuée à l'aide d'un
spectrophotomètre.
Pour nos réactions de PCR,
différents couples d'amorces peuvent être utilisés en fonction de l'analyse demandée.
Pour chaque couple d'amorces, un programme d'amplification PCR à 45 cycles est utilisé.
Sur chaque ADN extrait, au minimum deux réactions de PCR sont réalisées. Pour chaque
série de PCR, au minimum quatre contrôles (positifs et négatifs) sont utilisés afin de
pouvoir valider les résultats des tests avec certitude. Lorsque les contrôles ne donnent
pas de résultats satisfaisants, tous les résultats de la série d'analyses sont rejetés
et l'analyse est recommencée au stade PCR ou extraction.
A l'ifra, l'amplification d'une
séquence au moyen de la technique PCR, la détection et la quantification des produits
d'amplification se font sur un appareil ABI Prism 7700 commercialisé par la société
Perkin Elmer. Cet appareil permet une lecture en temps réel du résultat d'amplification.
De plus, par le biais de PCR mutiplex, il est possible d'effectuer une quantification
très précise des OGM.
En absence d'information sur le
produit à analyser, la détection de la présence d'ADN d'origine OGM se fait par une
méthode de criblage du promoteur 35S du virus de la mosdfque du chou-fleur. Cette
séquence est présente dans le génome de toutes les plantes transgéniques autorisées
par la CE à la commercialisation en France (m;ifs Btl76, m;ifs Btl 1, m@fs MON8 10, mais
T25 et soja RRS), et plus généralement dans le génome de la majorité des plantes
transgéniques recensées à ce jour mais n'ayant pas encore obtenu d'autorisation de mise
sur le marché. Ce test PCR permet de révéler la présence ou non de séquences
d'origine OGM (de type promoteur 35S) dans un échantillon. Dans le cas d'une réponse
négative, le test P35S permet de conclure à l'absence d'ADN d'origine OGM. Dans le cas
d'une réponse positive, ce test pen-net de quantifier la proportion d'ADN d'origine P35S
par rapport à l'ADN de l'espèce végétale pour des matrices simples. Cette
quantification est directe et précise sur l'ABI Prism 7700 car il est possible de
réaliser les deux réactions PCR simultanément dans un même tube. Il est toutefois
recommandé de procéder à l'identification du ou des transgènes présents pour
confirmer les résultats d'une analyse d'OGM de type quantitatif.
Outre le test P35S, il est
également possible de réaliser un test Tnos pour la détection d'une séquence du
terminateur nos. En effet, cette séquence est également présente dans le génome de
certaines plantes transgéniques autorisées par la CE à la commercialisation en France
(mais Btl 1, mais MON810 et soja RRS). En revanche, cette séquence étant absente du
génome de 2 mais transgéniques (mais Btl76 et m;ifs T25), le test Tnos est moins
puissant que le test P35S.
A ce jour, les seuls standards
certifiés commercialisés ont été élaborés soit à partir du mais Btl76 (qui ne
contient pas le promoteur nos), soit à partir du soja RRS et plus récemment à partir de
maïs Btl 1. En revanche, aucun standard certifié n'est disponible pour les m;ifs MON810
et T25.
L'absence de fragment
d'amplification signifie soit l'absence d'ADN d'origine OGM, soit une inhibition de la
réaction PCR, soit l'absence d'ADN extractible dans la matrice. C'est pourquoi, il est
préférable de s'assurer que l'ADN extrait est amplifiable. Nous disposons de plusieurs
couples d'amorces nous permettant de révéler la présence d'un gène existant de
manière constitutive dans l'espèce végétale suspectée d'intervenir dans la
composition de produit analysé. Ainsi, si le produit à analyser est à base de soja,
nous vérifierons que la réaction PCR n'est pas inhibée en mettant en évidence la
présence du gène de lectine. Si le produit à analyser est à base de ma:fs, nous
vérifierons que la réaction PCR n'est pas inhibée en mettant en évidence la présence
du gène de zéine. Dans le cas de matrices complexes (à base de mais et de soja), il est
nécessaire de réaliser les deux types de réactions. L'amplification d'un gène de
l'espèce permet de valider les résultats obtenus avec le test 35S. En revanche,
l'absence de fragment d'amplification signifie soit l'absence d'ADN de l'espèce, soit une
inhibition de la réaction PCR. C'est pourquoi, nous vérifions que l'ADN extrait est
amplifiable en ajoutant dans le tube de réaction PCR une quantité limite d'un standard
positif.
Le laboratoire ifra a mis au point
une méthode de détection sensible et quantitative des OGM. L'utilisation de la
technologie TaqMan (PCR à déplacement de sonde fluorescente) nous permet aujourd'hui de
détecter moins de 10 pg d'ADN OGM. Nous sommes à même de déceler la présence d'une
graine de mais ou de soja transgénique au milieu d'une dizaines de kilogrammes de mais ou
de soja traditionnel, ce qui nous permet de distinguer les vrais mélanges avec des
graines transgéniques, de contaminations accidentelles lors du transport, du stockage ou
de la transformation des matières premières.
taille de l'échantillon doit être d'au moins 100 grammes.
Merci à toutes les petites fourmis (non transgéniques) pour la collecte
des infos.